Vamos a comenzar a describir el último tema de la asignatura que son los
métodos automáticos de análisis. En ellos vamos a ver una primera
introducción con la clasificación y los conceptos de los métodos
automáticos, así describiremos los métodos discontinuos, los continuos y
los robotizados, y después nos centraremos en los métodos de análisis
proyección en flujo que son los métodos continuos por aquello de que son
los más utilizados. Describiremos la instrumentación, los fundamentos
teóricos y las aplicaciones. Comenzamos con el tema de los métodos
automáticos de análisis. El progreso de la ciencia y la tecnología ha
dado lugar a la necesidad de monitorizar y controlar un elevado número de
muestras exigiendo cada vez más el desarrollo de nuevos métodos que
reúnan el mayor número de ventajas en cuanto a la selectividad,
sensibilidad, bajo consumo de las muestras, reactivos, etc., y por supuesto
la frecuencia en el análisis. En ocasiones el elevado número de muestras
a las que tiene que enfrentarse el analista hace que éste tenga que
recurrir a métodos con una mínima manipulación y un mínimo consumo de
tiempo, es decir, a los métodos automáticos de análisis. Durante las
últimas décadas se han aparecido en el comercio sistemas de analíticos
automáticos capaces de efectuar toda serie de operaciones químicas y
manipulaciones con la mínima intervención humana. Se han desarrollado
ingeniosos aparatos que pueden medir cantidades determinadas de muestra, de
reactivos y mezclarlos, llevarlos a una temperatura deseada, efectuar
separaciones e introducir la muestra en los distintos espectrofotómetros,
cromatógrafos u otros instrumentos, y así como registrar la señal
correspondiente y todo ello de forma automática. Si hacemos una
clasificación de los métodos automáticos para el análisis de muestras
en disolución puede ser el siguiente. Métodos los podemos clasificar en
discontinuos, continuos y robotizados. Y dentro de los métodos continuos
podemos distinguir entre los métodos continuos de flujo segmentado y los
métodos continuos de flujo no segmentado, donde estaría el análisis por
inyección en flujo. En los métodos discontinuos las muestras se mantienen
separadas en recipientes individuales donde tienen lugar las diferentes
etapas del proceso analítico. Preparación de la muestra, definición de
la muestra, disolución, separación, medida, calibración, tratamiento,
etcétera. Por último las muestras se llevan al detector donde se obtiene
la señal correspondiente y de ahí a un registro. Estos sistemas son
lentos, tediosos y están sujetos a una continua manipulación de la
muestra por lo tanto están sujetos a las frecuentes o posibles errores del
analista. Dentro de los métodos continuos, en los sistemas continuos la
muestra se incorpora en un flujo de líquido o de un gas donde van
transcurriendo diferentes operaciones señaladas anteriormente, que puede
ser por ejemplo separación, tratamiento de la muestra, disolución,
reacción, etcétera. Desde ahí se introduce la muestra y ésta se hace
llevar junto con los reactivos que se quiera hasta un detector de forma
continua. Como hemos mostrado en el esquema de la clasificación existen
dos tipos diferentes de sistemas en flujo continuo. Los sistemas o
analizadores de flujo continuo segmentado y los sistemas o analizadores de
flujo continuo no segmentado, donde encontramos repito el análisis por
condición de flujo. El sistema de flujo segmentado fue propuesto por SICS
en 1957. Con los análisis clínicos comenzaron a aumentar exponencialmente
el número de los ensayos demandados en los laboratorios. Un sistema de
flujo continuo segmentado consta de los siguientes componentes. Una bomba
peristáltica que aspira continuamente la muestra y los reactivos, un
conjunto de tubos de plástico llamado manifold que permite la conducción
de los líquidos hasta un detector y las muestras aspiradas son segmentadas
inyectando burbujas de aire que deben ser eliminadas previamente a la
entrada en el detector. En los métodos de flujo no segmentado, como
acabamos de decir, se divide la muestra en segmentos discretos o bolos que
van separados por burbujas de gas. Estas burbujas de gas forman barreras
para evitar que la muestra se extienda a lo largo del tubo como
consecuencia de los fenómenos de dispersión. Además disminuyen la
contaminación que puede existir entre diferentes muestras. Con este
método se aumenta enormemente la frecuencia del muestreo y se ahorra
volumen de reactivos. En los métodos de flujo no segmentado, la muestra es
inyectada directamente en el flujo sin utilizar burbujas de aire para la
separación. En estos métodos suele no alcanzarse el equilibrio físico ni
químico en el momento justo de la detección del analito y su
instrumentación en general es un poco más sencilla y más barata que los
métodos anteriormente descritos. Es decir, no hay burbujas y va
simplemente el portador o los reactivos y a continuación el bolo de la
muestra. Los métodos robotizados consisten en la utilización de un
minirobot que mimetiza las operaciones llevadas a cabo por la persona para
desarrollar el método analítico. Estos métodos pueden considerarse como
una modalidad de los métodos automáticos discontinuos, si bien hasta el
momento no se han utilizado demasiado en la práctica analítica ordinaria.
Aquí vemos unos ejemplos en esta diapositiva. Dentro de los métodos
continuos de flujo no segmentado hemos dicho que se encontraba el análisis
por inyección en flujo. Vamos a pasar ahora a detallar un poquito más,
hablaremos ahora a continuación más detalladamente de este tipo de
análisis. El análisis por inyección en flujo, más conocido por el
acrónimo FIA, se desarrolló a mediados de los años 70 como una técnica
muy eficaz para el análisis automatizado de muestras. Fue desarrollado por
los investigadores Rutsika y Hansen en Dinamarca. Aunque parece realmente
muy semejante al método de flujo no segmentado, es muy distinto en la
práctica y los resultados también son distintos. El análisis por
inyección en flujo se basa en inyectar una muestra en una corriente de
líquido en movimiento que contiene el resto de los reactivos, y de ahí
hacerla pasar hasta un detector. La instrumentación básica está formada
por las siguientes partes. En realidad son prácticamente los mismos
componentes que hemos descrito para el análisis de flujo segmentado. Es
decir, está formada por una bomba peristáltica capaz de impulsar la
muestra y los reactivos, un conjunto de tubos de plástico, repetimos que
es el manifold, que conducen los líquidos hasta el detector, pero a
diferencia del sistema de flujo segmentado, aparte de que no existe unas
burbujas entre medias de distintas muestras, la muestra en lugar de ser
aspirada continuamente como ocurría en los de flujo segmentado, la muestra
es inyectada en este caso, es decir, se intercala y se inyecta en una
disolución portadora o carrier mediante una válvula de inyección y se le
va haciendo confluir con los distintos reactivos necesarios para el método
hasta llegar al detector. Por tanto, los componentes fundamentales serían
la unidad de propulsión o bomba peristáltica, válvula de inyección,
sistema de transporte y la detección. Respecto a la unidad de propulsión,
es decir, la bomba peristáltica, tiene como misión establecer un flujo de
caudal lo más constante posible, ausente de impulsos y perfectamente
reproducible. La forma más generalizada de propulsión se basa en la
utilización de bombas peristálticas. Consisten básicamente en un tambor
conteniendo una serie de rodillos los cuales comprimen un tubo flexible por
el cual circula el reactivo o el carrier. Los tubos son construidos de un
material de plástico flexible siendo los de Taigón los más utilizados,
pero cada tubo constituye un canal de un líquido distinto. Es decir,
tenemos rodillos y distintos canales por los cuales nosotros introducimos
diferentes tubos y en cada tubo se introduce distintos reactivos. El flujo
o caudal depende de la velocidad de giro del cabezal y del diámetro del
tubo flexible. Por ello, un mismo cabezal girando a una velocidad
determinada, si nosotros ponemos diferentes tubos, es decir, tubos de
diferente diámetro interno en sus canales podemos impulsar
simultáneamente distintos caudales. Generalmente se opera con tubos de 0,5
a 1 mm de diámetro interno y las velocidades de flujo con las que se
trabaja andan comprendidas entre 0,5 y 5 ml por minuto. Respecto a los
sistemas de inyección lo más utilizado es la válvula de inyección de 6
vías que es la que encontramos en esta diapositiva. Este componente del
FIA tiene como misión situar una cantidad perfectamente definida de
muestra en la corriente del portador o carrier. Actualmente casi todos los
sistemas FIA utilizan válvulas rotatorias para insertar la muestra en el
flujo. De ellas, la más utilizada es la válvula rotatoria de 6 vías que
se muestra en esta figura. La válvula tiene dos posiciones, la de carga y
la de inyección que mediante un giro de 90° se intercambian estas
posiciones de las vías de manera que la muestra contenida en un tubo de
volumen conocido se introduce en la corriente del fluido portador. Con este
sistema se consigue una buena reproducibilidad de volúmenes suministrados,
se consigue una buena rapidez y desde luego tiene mucha facilidad de manejo
así como una aceptable capacidad de automatización. En el sistema de
carga vemos que la muestra se va cargando, rellena un bucle de inyección
de un volumen determinado y en principio se está desechando. El portador
pasa por otro canal y de ahí va al sistema. Cuando nosotros giramos la
válvula y lo ponemos en la posición de inyección se conecta el portador
con el volumen de la muestra que nosotros queremos introducir de inyección
y de ahí la pasaremos al sistema y a la parte de inyección. Los sistemas
de transporte y mezclas de reacción consisten en un conjunto de tubos y
conectores generalmente de teflón por donde fluyen los reactivos y la
muestra. En los sistemas de inyección en flujo normalmente se incluye una
sección de tubo en espiral o hecha con una serie de nudos denominada bucle
de reacción, cuyo propósito es aumentar la dispersión axial e
incrementar la mezcla radial de la muestra y el reactivo lo que produce
picos más altos al aumentar el rendimiento de la reacción. Los diámetros
internos de los tubos empleados en FIA son de 0,5 mm pero pueden variar de
0,3 hasta 0,8 mm. En la figura se esquematiza una corriente de disolvente
portador en la que se fuerza a pasar de forma continua a través del
inyector y se añaden volúmenes entre 40 y 190 microlitros. La corriente
portadora se combina con una corriente de reactivo y la disolución
resultante pasa a través de una espiral de modo que se mezcle con el
reactivo y de la muestra. La concentración del analito en la muestra se
determina midiendo la absorbancia de esa corriente portadora tal como se
muestra en la figura. En esta otra figura que tenemos aquí es un poco más
compleja además de la reacción química de una muestra con un reactivo
determinado para formar un determinado compuesto y medirlo por la
detección puede haber otros tipos de tratamiento de la muestra como por
ejemplo puede ser la separación por diálisis o una extracción
líquido-líquido, difusión gaseosa, etc. En este ejemplo vemos que se
quiere determinar aluminio que es el que se inyecta por una válvula de
inyección B y además se le pone un medio ácido que se requiere. Se le
pone como reactivo el HMTA y una disolución de agua que finalmente
servirá como separación de fases. El HMTA se mezcla con el aluminio, con
el medio ácido y pasa a una columna donde se retiene el analito. Una vez
que éste sea retenido, se diluye con el medio ácido y se le mezcla con
una disolución de éter y un reactivo, el dbq. El aluminio forma un
complejo con el dbq en medio orgánico que se separa en un punto
determinado mediante un separador de fases que puede ser de distintos
tipos, en forma de T o de membrana y la fase orgánica es la que pasa hacia
el detector. Es decir, la fase orgánica formada por el complejo
dbq-aluminio en un medio orgánico de éter pasa al detector y se detecta
la señal analítica. Esto se ha aplicado para aluminio en alimentos para
la determinación de aluminio en líquidos de diálisis para determinación
de zinc en muestras biológicas, etc. Es un ejemplo más complejo que los
anteriores pero para que se hagan una idea de lo que se puede realizar con
un sistema de análisis por emisión en flujo. Respecto a los detectores,
los más utilizados en análisis por emisión en flujo son los
espectrofotométricos como son los fotométricos, los florimétricos o de
cualquier otro tipo. También se utilizan en sistemas que sean
electroquímicos como pueden ser amperométricos o potenciómétricos. Se
utilizan también los refractómetros y los espectrómetros de emisión y
absorción atómica. Se pueden unir a la llama en absorción e emisión
atómica como vimos en las veces pasadas. Si el detector es un detector
fotométrico o florimétrico es decir, es espectrofotometría molecular de
ultravioleta visible o de fluorescencia de emisión molecular requiere una
célula especial para el paso de la corriente portadora. La célula es la
que se muestra en esta diapositiva en la que se continúa, por así
decirlo, el flujo dentro de la propia célula de flujo. Respecto a los
fundamentos que nosotros podemos comentar de lo que es el sistema de
análisis por emisión en flujo comenzaremos hablando del tipo de señal
que se obtiene en este sistema de inyección en flujo. La señal obtenida
en un sistema FIA se denomina FIA-grama, es una señal transitoria. Se
trata de la representación de la señal medida absorbancia, fluorescencia,
diferencia de potencial intensidad de corriente, etc. frente al tiempo. Los
parámetros que se pueden distinguir en esta señal analítica los vemos
ahí son la altura de pico que hace referencia a la concentración del
analito T, que sería el tiempo de residencia que es el tiempo transcurrido
desde la inyección hasta que se alcanza la señal máxima T' que sería el
tiempo de retorno que es el tiempo comprendido desde que se alcanza la
señal máxima hasta que se vuelve de nuevo a la línea base y T' que
sería el tiempo de arranque o tiempo de aparición que es el tiempo
transcurrido entre la inyección y el inicio del FIA-grama. Incremento de T
evidentemente será el tiempo de duración del pico. Respecto a la teoría
del FIA podemos decir que los fundamentos teóricos de este sistema de
inyección en flujo están relacionados con la dispersión que puede
definirse como la dilución que sufre un volumen de muestra inyectada en el
flujo en un sistema determinado. A la dispersión contribuyen una serie de
factores tanto de tipo físico como de tipo químico cuando ocurre una
reacción química entre alguno de los componentes del flujo y de la
muestra. Cuando se inyecta una muestra en el flujo portador inicialmente el
perfil del flujo es rectangular. Cuando la muestra pasa por una zona de
mezcla y de reacción la anchura del perfil del flujo aumenta a medida que
la muestra se dispersa en el interior del flujo portador. La dispersión,
por tanto, tendrá lugar debido a dos procesos la convección de la muestra
y el desplazamiento del flujo portador y la difusión debido al gradiente
de concentración entre la muestra y el flujo portador. La convección de
la muestra se produce por un efecto de flujo laminar en el que la velocidad
lineal de la muestra en las paredes del tubo es igual a cero mientras que
en el centro del tubo es la forma más importante de dispersión en los
primeros 100 microsegundos después de la inyección de la muestra. En la
figura vemos este proceso de convección justo en el punto A que es el
momento de la inyección que no existiría convección en el punto B que
predomina una convección en el C que hay una convección y difusión y
finalmente en el punto D que predomina la difusión. La segunda
contribución que hemos dicho a la dispersión de la muestra es la
difusión y esta se debe al gradiente de concentración entre la muestra y
el flujo portador que se produce de forma paralela y perpendicular al flujo
portador aunque sólo la última en los extremos del mismo la muestra
experimenta un aumento de su velocidad lineal. La difusión ayuda a
mantener la integridad del perfil del flujo de la muestra evitando que esta
y el flujo portador se dispersen uno en el otro. Tanto la convección como
la difusión contribuyen de forma importante a la dispersión en los
aproximadamente 20 o 25 segundos la difusión es ya el único componente
importante de la dispersión. Los factores que afectan a la dispersión son
los que tenemos en esta figura es decir, fundamentalmente el volumen de la
muestra que inyectamos el caudal o el flujo del portador y la longitud en
la diapositiva es decir, cuanto mayor sea el volumen de inyección de la
muestra menor será la dispersión. Respecto al caudal cuando aumenta el
caudal disminuye también la dispersión como vemos en los ejemplos y
cuando aumenta la longitud del tubo aumenta también la dispersión.
Respecto a las características que nosotros podemos encontrar del sistema
de inyección en flujo pues podemos distinguir la sensibilidad es decir,
los métodos FIA son menos sensibles en general que los métodos manuales
debido a la existencia de esta dispersión de la que estábamos hablando ya
que se obtienen rendimientos parciales como consecuencia de tiempos de
reacción más pequeños además en general no se alcanza el equilibrio
químico en la reacción. Una forma de aumentar la sensibilidad consiste en
utilizar la técnica de parada en flujo lo que se denomina stop flow que
permite que la reacción transcurra hasta completarse. Para utilizar esta
técnica es necesario un dispositivo de control del tiempo que detenga la
bomba en momentos precisos. Respecto a la selectividad es cierto que estos
no reaccionan en corto espacio de tiempo en la que transcurre la reacción
de la inyección y la medida. La precisión conseguida en la metodología
FIA es superior a la que se obtiene en los métodos manuales la rapidez es
sin duda alguna la característica más sobresaliente de estos métodos ya
que superan claramente los métodos manuales y el coste de la técnica son
análogos. Este bajo coste no sólo se refiere a la instrumentación sino
también al consumo de los reactivos y de muestra. La versatilidad habrá
que comentar aquí que el método de analiza de inyección en flujo es un
método muy sencillo en cuanto a la instrumentación y se puede utilizar en
cualquier laboratorio analítico tal y como se utilizan los pH-metros, las
técnicas de análisis por inyección en flujo se han aplicado a una amplia
variedad de muestras ambientales, clínicas, agrícolas, industriales y
farmacéuticas. Se han desarrollado métodos analíticos cuantitativos como
para contaminantes cationicos aniónicos y moléculas moleculares de las
aguas residuales por ejemplo o de las aguas corrientes para proporcionar un
control continuo es decir, in situ de los contaminantes en las condiciones
de campo. El análisis por inyección en flujo tiene también numerosas
aplicaciones en el estudio de muestras clínicas para las que se utilizan
métodos tanto enzimáticos de glucosa, urea, osuero en sangre, etanol,
etcétera como no enzimáticos para determinar cobre, cloruro, fosfatos
etcétera. Se han utilizado mucho para el desarrollo de diferentes sensores
tanto físicos como químicos y la tendencia de las metodologías por
análisis por inyección en flujo es disminuir los pasos de pretratamiento
de la muestra y miniaturizar las metodologías de forma automatizada para
que los errores de manipulación sean menores y aumenten la precisión de
los resultados y la disminución de reactivos y por tanto de desechos
claves para mejorar el control de calidad de las mediciones analíticas. En
un laboratorio de rutina por ejemplo muchas veces no es posible realizar
las determinaciones por replicado ya que se tienen que analizar muchas
muestras y el costo del análisis sería muy elevado por lo que hace que el
análisis por inyección en flujo